1.紫外-可见光谱鉴别法 多数有机药物分子中含有能吸收紫外可见光的基团,从而显示特征吸收光谱,这是紫外-可见光谱鉴别法的依据。鉴别时一般采用对比法,按规定的方法配制供试品溶液与对照品溶液,通过对比吸收光谱的特征数据、吸收度或吸收系数、吸收光谱的一致性等进行鉴别。由于紫外-可见吸收光谱比较简单,光谱的曲线形状变化不大,专属性不如红外光谱,同一物质图谱相同,但图谱相同的却不一定为同一物质。但由于紫外-可见分光光度法比较方便,所以制剂的鉴别一般不采用红外分光光度法,而采用紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法应用时,主要有以下几种方式。
(1)规定波长处最大或最小吸收,一般是特征吸收波长位置(λmax或λmin)。
如盐酸伪麻黄碱鉴别项下要求“取本品,加水制成每1mL中含0.5mg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在251nm、267nm与263nm的波长处有最大吸收”。
如芬布芬鉴别项下要求“取本品,加无水乙醇制成每1mL中约含5μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在281nm的波长处有最大吸收,在238nm的波长处有最小吸收”。
(2)测定一定浓度的供试液在最大吸收波长处的吸光度。
如棕榈氯霉素鉴别项下要求“取本品,加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1mL中含20μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在271nm波长处有最大吸收,其吸光度约为0.35”。
(3)吸收系数法:测定吸收波长,计算吸收系数。
如氢化可的松性状项下要求“取本品,精密称定,加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1m.中约含10μg的溶液,照紫外-可见分光光度法,在242mm的波长处测定吸光度,吸收系数为422～448”。
(4)吸光度比值法:测定不同波长处的吸光度,比值在一定范围内。可以是吸收峰与吸收峰的比值,也可以是吸收峰与吸收谷的比值。
如丙酸倍氯米松鉴别项下要求“取本品,精密称定,加乙醇溶解并定量稀释制成每1mL中约含20μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在239nm的波长处有最大吸收,吸光度为0.57～0.60;在239nm与263nm的波长处的吸光度比值应为2.25～2.45”。
(5)样品经化学处理后,测定反应生成物的吸收光谱特性。
以上方法可以单个应用,为了提高鉴别的专属性,也可以几种方法结合起来使用,如丙酸倍氯米松的鉴别。
2.红外光谱鉴别法 红外光谱鉴别法是一种专属性很强、应用广泛的方法,主要用于组分单一、结构明确的原料药,特别是结构复杂、用其他常用方法不易区分的药物,并且适用于固体、液体甚至是气体的样品鉴别。
应用红外光谱进行鉴别试验时,药典采用标准图谱对照法。在药典规定的条件下测定供试品的图谱,然后与国家药典委员会编订的《药品红外光谱集》对照。
《药品红外光谱集》分卷出版,分别为第一卷(1995年出版)、第二卷(2000年出版)、第三卷(2005年出版)、第四卷(2010年出版)。每次新版中收载的药品红外光谱图包括新增品种和老品种重新绘制的图谱。所以,如果同一化合物的图谱在不同卷上均有收载时,用于鉴别时以后卷图谱作为比对依据,前卷光谱图仅作为参考。光谱图中的横坐标为波数(cm-1),纵坐标为透光率(T%)分辨率为2cm-1,基线一般控制在90%透光率以上,供试品取量一般控制在使其最强吸收峰在10%透光率以下。
原料药的鉴别除另有规定外,应按照《药品红外光谱集》各卷收载的各光谱图所规定方法制备样品。常用的制备方法有压片法、糊法、膜法、溶液法、衰减全反射法和气体法等。
组成相对稳定的多组分原料药鉴别不能采用全光谱比对,需参照原料药的标准光谱,在指纹区内选择主要成分的若干个特征谱带作为鉴别的依据。
制剂鉴别应按品种鉴别项下规定的前处理方法处理,通常是采用溶剂提取法。提取时应选择适宜的溶剂,尽可能减小辅料对鉴别结果的干扰,并且避免导致提取过程中药物晶型的转变。提取后的样品经适当干燥后依法进行鉴别。
在比对光谱时应注意以下儿点。
(1)辅料无干扰,待测成分的晶型不变化时,可直接与原料药的标准光谱进行比对。
(2)辅料无干扰,而待测成分的晶型有变化时,可用对照品经同法处理后的光谱比对。
(3)待测成分的晶型不变化,而辅料存在不同程度的干扰时,可参照原料药的标准光谱,在指纹区内选择3~5个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的依据。鉴别时,实测谱带的波数误差应小于规定值的0.5%。
(4)待测成分的晶型有变化,辅料也存在干扰,此种情况一般不宜采用红外光谱鉴别。
对照时一般先看最强峰的吸收位置、形状、数目等是否一致,然后再检查中等强度峰和弱吸收峰是否对应,如果供试品的红外光吸收图谱与对照品的图谱完全一致,一般可认为是同一种化合物(只有少数例外,如有些光学异构体或大分子同系物等)。若两光谱图不同,则可判定两化合物不同。但是在实际操作中由于绘制图谱时受药物粉末细度、吸水程度、试样的处理和制备等多种外界条件的影响较大,图谱易发生变异,因此在图谱对照时,要充分考虑各种因素可能造成的影响。
药典一般不单独用本法进行鉴别,常与其他理化方法联合进行鉴别。
如硫酸阿托品鉴别项下规定:①本品(试样制备:KBr压片法)的红外光吸收图谱应与对照的图谱(《药品红外光谱集》一致;②本品显托烷生物碱类的鉴别反应;③本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。