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马普科学仪器公司
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高速钙离子成像系统

      钙离子是生命活动中最重要的离子之一,通过测定细胞内游离钙离子浓度,科研工作者可以得知肌肉收缩、神经信号传导、细胞间通讯、激素反应等生命活动的重要信息。目前世界上胞内钙离子的主要测量方法分为电测量法光测量法。电测量法利用细胞膜片钳技术测定钙电流引起的细胞膜电位的变化。光测量法利用能与钙离子特异性结合的荧光探针来测定细胞荧光强度的变化。而更为准确和先进的方法则是光电联合测量法,这两者相互印证、相互辅助,可以得出离子浓度变化的准确信息。光电联合测量法利用标准溶液来制作标准曲线,甚至可以测量出胞内钙离子的绝对浓度,是目前世界上测量胞内游离钙离子浓度最为权威的方法之一!
     单细胞膜片钳测定系统和离子荧光比例测量系统是两套既互相独立又协同工作的系统。细胞膜片钳系统用于测定特定生物反应和生命活动时膜电位的变化,离子荧光比例测量系统用于测量细胞钙离子浓度的变化及其绝对值。
  
一、原理:
      采用钙离子荧光探针对细胞内钙离子等信使物质进行定量测定是研究细胞分泌活动的重要技术手段。其基本原理是:用荧光探针标记样本中的钙离子,根据样本中的荧光探针特性单色光源发出单色光,诱发出荧光。然后根据传感器检测到的荧光特性即可分析样本中的钙离子浓度。

     测量时一般采用单波长法和双波长比率测量法,因双波长比率法的灵敏性和方便得到更广泛的应用,其原理是:探针与钙结合后不仅产生荧光强度的变化,而且有激发光或发射光谱偏移。激发峰偏移者进行双激发比例荧光测量,如fura-2;发射峰偏移者进行双发射比例荧光测量,如indo-1。一般选择对钙离子敏感而荧光强度变化相反的两个波长,如fura-2的340/380,可获得最大的比值(Ratio),进而利用Grynkiewicz公式求出游离钙离子的浓度。 Grynkiewicz公式:[Ca2+]i=Kd×β(R-Rmin)×(Rmax-R)。其中,Kd为Fura-2和钙离子结合的平衡解离常数,β是胞内零钙和饱和钙时在380nm的荧光强度比值,R是Ratio比值,Rmin是零钙时Ratio值,Rmax是饱和钙时的Ratio值。此检测方法定量,具有快速、灵敏等优点。应用荧光分光光度仪、荧光显微镜系统,光电倍增器检测或增强照相机检测,即可获得校准的细胞内Ca2+浓度。还有其他一些指示剂在不同的实验中也得到了应用。

Fura-2:双波长340/380nm激发;单波长510nm Ca++测量
Fura-3:单波长490nm激发;单波长530nm Ca++测量.
Indo-1:单波长350nm激发;双波长405/480nm pH测量
BCECF:双波长430/480nm激发;单波长530nm pH测量

二、系统组成:
高速钙离子成像系统由下列部分组成:
单色光源:
     
为荧光指示剂提供激发光源,并能使激发光在不同波长之间快速切换。实现ms级激发
     光 波长的转换,一般选择 美国SUTTER的DG4为光源。
CCD摄像头:
     
科研级摄像头,它的灵敏度高低、信噪比大小直接影响到实验的结果,常用的  美国
     Roper公司的各种科研级的摄像头。
记录分析软件:
      
带有CCD、光源等周边设备软件控制模块,2、8、16、24、48位图像显示 与处理功
      能模块,2D反卷集、3D构建、多种形态学参数及距离测量模块。同时还具有荧光强度
      比例成像的数据采集与处理功能。目前常用的软件有美国MDC公司UIC系列软件,
      如MetaMorph/ MetaFluor 专业钙离子图像分析处理软件,
荧光显微镜各大著名公司的荧光倒置显微镜。

      此系统中单色光源提供单色激发光,随后将激发光引入荧光显微镜;荧光显微镜将激发光聚焦于样本平面以诱发荧光; CCD摄像头采集荧光信号。计算机控制单色光波长的切换、记录分析软件采集荧光信号并进行数据处理。

三、应用:
神经生物学:离子浓度改变引发的信号发射
生理学:肌肉运动-心肌细胞中的钙信号
细胞生物学:信号传导;离子通道
发育生物学:卵受精机制
药物学:筛选药物、药效学考察等方面

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