IonWorks Quattro
高通量电生理学筛选 
在制药工业上，离子通道是一类高效而且尚未阐明的靶点。传统的一次性单细胞膜片钳是研究离子通道的“金标准”，这种方法需要大量的人力，而且不适合早期药物研发中进行大量化合物的筛选。因此，作为离子通道活性研究的替代方案，使用例如配体置换，离子通量和膜电位技术，不过由于缺少电压控制，这些实验无法将一些离子通道维持在某种构象状态。最近的膜片钳技术开启了离子通道筛选的新纪元，使用直接电生理学测定，可以使用几种设备，包括来自分子仪器公司的IonWorks® HT 和 PatchXpress® 7000A 系统。尽管这些系统比起传统的膜片钳提供了相当高的通量，不过仍然急需要能够匹配替代实验的通量，同时降低每一个化合物测定的成本。为了达到这样的目标，分子仪器公司开发了具有Population Patch Clamp™ (PPC)技术的IonWorks® Quattro™系统。
来自分子仪器公司的 IonWorks® Quattro™ 系统—下一代离子通道筛选工具:
- Population Patch Clamp™技术
- 一致性和数据质量
- hERG药理
- 与原来PatchPlate™的兼容性
- 超过FIonWorks® HT 4倍的通量
- 减少每个数据点的成本
- 规格
生物差异（例如细胞健康，细胞大小和通道表达水平）是在平面膜片钳系统中降低成功率的主要因素。为了纠正这些因素，IonWorks HT系统最初设计用来增加对一式四份中每个化合物通过吸液管混合获得至少一个成功记录的可能性。因此对每个化合物使用一个细胞获得至少一个成功纪录的70%的可能性是99.2%；可是通量太低。通过消除一式四份的方法，在IonWorks系统可以迅速的实现4倍通量的增加。为了达到这个目标，分子仪器公司开发了Population Patch Clamp™ (PPC) 技术，这种创新性方法记录了一个表达重组电压门控离子通道的细胞株中的平均离子电流。细胞被接种到384孔的PatchPlate PPC™基片上，每个通道包含了多个记录点(图 1).
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图 1. IonWorks Quattro 系统使用Population Patch Clamp™ 技术。每个 PatchPlate PPC 基片上包含了多个记录点。 |
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一致性和数据质量
因为离子电流从一个细胞株测量得来，试验期间IonWorks Quattro 系统在各个孔中测量的平均电流具高度的一致性。IonWorks Quattro 系统测量的电流的变异系数大大降低了。对于IonWorks Quattro 和IonWorks HT 系统，Kv1.3电流的%CV分别是8%和34%；Nav1.5电流的%CV分别是18%和44%；hERG电流分别是28%和50%。 来自于PPC记录的原始数据在图2中显示。
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图 2. 在 IonWorks Quattro使用PatchPlate PPC 基片测量的Kv1.3, Nav1.5 和hERG 电流的原始数据。 |
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如此高的成功率 (超过 95%, 表1) 未必要采用测试多余的4通道的化合物，因此比起第一代IonWorks HT 系统，立刻提高了4倍的通量。用Kv1.3 , Nav1.5 和 hERG 表示的细胞成功率总结在表1。
表 1. 比较 IonWorks Quattro 和IonWorks HT 系统的百分率 (%).
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PPC |
Single Hole |
| 离子通道 (双向) |
平均值 |
SD |
平均值 |
SD |
| Kv1.3 (CHO) |
99.3 |
0.5 |
80.1 |
7.7 |
| Nav1.5 (CHL) |
95.5 |
3.2 |
71.3 |
7.1 |
| hERG (CHO) |
97.3 |
2.4 |
61.0 |
12.0 |
双尾的不配对T-检验 p < 0.01.
提高的数据质量带来了对于稳定性离子通道靶点单点筛选和药理实验所需的稳定性和一致性。 在IonWorks Quattro 试验中，通道间的变化稳定，可以获得稳定的Z''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''-因子, 与FLIPR® 系统中Z''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''-因子值相近(图 3)。
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图 3. 在IonWorks Quattro 系统上对 Kv1.3 药理试验的Z''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''-因子。4-氨基吡啶(4-AP)的10点剂量反应，已标准化至对照 (混合前)电流大小。384-孔混合板包含了4-AP 滴定的32个副本。从32孔阳性对照(6 mM 4-AP)和32孔阴性对照（指用于细胞外缓冲液）计算Z''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''-因子。 |
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IonWorks Quattro 系统增加的通量对于很多在单个试验中的化合物，可以产生理想的复杂药理结果。使用96- 或者 384-孔混合, 可以设计各种各样的剂量反应试验，包括从3-12 浓度的各种滴定—有或者没有重复。图4列举了从使用IonWorks Quattro系统的Kv1.3 药理试验中得出的集中分布数据。 每个数据点有每个浓度的4个副本组成—注意IonWorks Quattro与IonWorks HT相比产生的误差棒要短得多。
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图 4. 在IonWorks H（左）和IonWorks Quattro系统（右）上测量的4-AP 对于CHO细胞上表达的 Kv1.3 通道的抑制作用IC50 值比较。 |
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hERG 药理
在IonWorks Quattro系统上使用单孔和PPC 基片，测试八个具有已知的hERG 活性的参考化合物的效能(astemizole, cisapride, pimozide, flunarizine, quinidine, terfenadine和dofetilide)。当使用PatchPlate PPC基片时，对比单孔方式，数据变异性明显降低(图 5)。通过使用PatchPlate PPC基片和单孔值的比较，和以前报告的传统全细胞膜片钳电生理学值的比较，总结在表2中。 除了氟桂利嗪外，大多数值在文献报道的传统全细胞膜片钳测得值的3倍平均值范围内。除了氟桂利嗪是一种起效缓慢的化合物，即使使用传统的膜片钳(数据未显示)持续刺激10分钟后，没有达到稳定抑制状态 ,导致观察到在IonWorks Quattro右移，因为刺激限于5秒发出5个刺激。
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图 5. 在IonWorks Quattro中对每个已知的hERG 化合物确定其效能。比较使用原来的PatchPlate（单孔，左侧）和PatchPlate PPC (右侧) 基片得到的值。实验中细胞接种密度对于单孔是5 x 105 细胞/mL，对于PPC是2 x 106细胞/mL。. |
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表 2. 对于IonWork Quattro 和 IonWorks HT系统以及传统的膜片钳电生理学方法， hERG阻滞剂IC50 值的相关性 (单位 µM)。
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IC50 (µM) |
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单孔 |
PPC |
传统 |
| Astemizole |
0.006 |
0.024 |
0.0009-0.026 |
| Cisapride |
0.008 |
0.051 |
0.0065-0.044 |
| Pimozide |
0.013 |
0.09 |
0.001-0.018 |
| Flunarizine |
0.483 |
1.82 |
0.107 |
| Quinidine |
0.47 |
1.66 |
0.300-1.1 |
| Terfenadine |
0.105 |
0.439 |
0.007-0.204 |
| Dofetilide |
0.015 |
0.016 |
0.010-0.158 |
| Imipramine |
5.59 |
8.28 |
3.4 |
与原来的 PatchPlate消耗品的兼容性
IonWorks Quattro 系统和原来的单孔PatchPlate和新的PatchPlate PPC消耗品都兼容。 为 IonWorks Quattro 系统设计了新的放大器，允许用户在两个PatchPlate 选项之间切换。 当在开始每个试验，在软件中配置试验协议时，用户只要简单选择PatchPlate类型。
比IonWorks HT增加了4倍的通量
Population Patch Clamp技术比起IonWorks HT 系统，增加了4倍的通量—已经是市场上最高的电生理学系统通量。 每年使用IonWorks Quattro系统采集的数据点最高可达400,000。
减少每个数据点的成本
由于IonWorks Quattro 系统通量的增加，相对 IonWorks HT 系统，每个化合物的测量成本锐减了50%。
分子仪器公司有几个具体的财务分析工具用于评估全负荷运营费用和毛利润 ，可以和对建立离子通道感兴趣的筛选服务 CROs的分析不相上下。 了解更多信息，联系当地MDC 财务代表。
技术参数*
| 尺寸(英寸) |
55.6 (H) x 58.1 (W) x 32.5 (D) |
| 重量 (磅) |
550 (250 kg) |
| 所需真空 |
最小 120 mbar @ 0.6 m3/hr
26 in. Hg @ 0.35 cfm |
| 微孔板格式 |
支持标准的96- 和 384-通道格式 |
| PatchPlate 基片 |
支持原来的PatchPlate 和PatchPlate PPC 基片 |
| 测定时间 |
45-85 分种/384-孔 (由方法决定) |
| 集成12-通道移液器 |
准确度: 3.5 µl时> 95%
精度: 3.5 µl时< 10% CV |
| 电压钳放大器 |
集成的 48-通道放大器，可切换支持原来的PatchPlate 和PatchPlate PPC 基片 |
*技术参数可能会发生变化。
